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May 26, 2023

細菌性アミロイドカーリの構造解析と構築原理

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 2822 (2023) この記事を引用

1371 アクセス

13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アミロイドは意図しない凝集カスケードの（有毒な）副産物であるだけでなく、定義された生物学的機能を果たすために生物によっても生成される可能性があるという最初の命題から 20 年が経過しました。 その革新的なアイデアは、グラム陰性細胞を持続性バイオフィルムに保持する細胞外マトリックスの大部分が、クロスβ構造、核形成依存性の重合反応速度論、および古典的なタンパク質繊維（カーリー; タフィ）で構成されているという認識から生まれました。アミロイド着色特性。 インビボでいわゆる機能的アミロイド線維を形成することが示されたタンパク質のリストは、ここ数年で大幅に拡大したが、関連する実験的障壁のせいで、詳細な構造的洞察は同様のペースで進んでいない。 今回我々は、広範なAlphaFold2モデリングと極低温電子透過顕微鏡法を組み合わせて、カーリプロトフィブリルの原子モデルとその高次の組織化様式を提案する。 私たちは、カーリの構成要素とフィブリル構造の予想外の構造的多様性を明らかにします。 私たちの結果は、カーリの極端な物理化学的堅牢性の合理化、および種間のカーリ乱交の初期の観察を可能にし、カーリベースの機能性材料のレパートリーを拡大するためのさらなる工学的取り組みを促進するはずです。

かつては構造生物学のターゲットとしてはありえないと考えられていましたが、極低温電子顕微鏡法 (cryoEM) とヘリカルプロセシングの最近の発展により、ほぼ原子分解能でのアミロイド原線維の構造決定が容易になりました 1。 in vitroで生成されたアミロイドとex vivoで単離されたアミロイドの両方の実験的に決定された多数の構造により、線維多形の概念や、その他の点では同一または密接に関連した配列の株の概念を含む、線維構造の困惑するような構造的多様性が明らかになりました2、3、4、5。 プロトフィブリル構造と線維らせん対称性の違いにもかかわらず、ほとんどのアミロイド構造はいくつかの保存された特徴を共有しており、これによりアミロイドフォールドの定義を従来のクロスベータ格言を超えて拡大することが可能になります。 我々の知る限り、現在記載されているアミロイド構造はすべて、複雑で蛇行した平面状のβ鎖配列の繰り返しの積み重ねで構成されており、これらは立体ジッパーモチーフによって安定化されており、互いに入り込んだ残基側鎖が広範なファンデルワールス、静電性、疎水性、水素性を形成している。接着接点。 鎖-鎖ドッキングおよびβ-アーケード形成による平面ペプチドの軸方向のスタッキングは、プロトフィブリル形成を促進し、通常、その後、複数のプロトフィブリルがらせん状に巻き付いて、極めて安定ならせん状上部構造が形成されます。 まさにこのらせん対称性が、幅広いアミロイド構造の構造詳細を解明するための最新のクライオEMアプローチで大きな成功を収めているのです。

これらの構造のほとんどは、多くの（神経）変性疾患、全身性沈着疾患、およびミスフォールディング疾患と相関するアミロイド種のサブファミリーに属しています。 そのため、これらのアミロイド生成タンパク質は口語的には病理学的アミロイド (PA) と呼ばれます。 これらの疾患関連アミロイドは、突然変異、環境条件、または誤処理によって本来の構造に到達できずに不安定化したタンパク質またはタンパク質断片の非機能的かつ経路外のミスフォールディングおよび凝集イベントを表すという共通点を持っています。 アミロイドファミリーには、生命のあらゆる領域で見られる第 2 の系統があり、アミロイドの状態を採用することで専用の生物学的役割 (接着、貯蔵、足場など) を果たすように進化したタンパク質で構成され、これらのタンパク質に機能性アミロイド（FA）という用語6、7、8。 病理学的アミロイドと同様に、FA はクロスβ特性を持つ線維への核形成依存性の凝集を示します。 謎めいた疑問は、FA経路に、病的アミロイド沈着に一般的に関連する細胞毒性機能獲得特性を軽減するための選択された形質が含まれているのか、あるいは欠如しているのかということである。 Curli や Fap などの細菌性アミロイド経路の場合、早期のアミロイド生成を防止または停止するシャペロンのような保護手段を含む、アクセサリータンパク質がタイムリーかつ局所的なアミロイド沈着を確実にすることは明らかです 9,10。 しかし、FA サブユニットとファイバーの構造に細胞毒性を低下させる適応形質が含まれているかどうかは、ほとんどわかっていません。 興味深いことに、さまざまな病原菌によって産生されるFAがPAs11と交差反応性を示す可能性があることを示すインビトロ実験があり、ヒトにおける直接交差播種または間接（炎症）効果による病的アミロイド沈着の感染性の誘導または悪化の可能性についての報告がある。細菌性アミロイドに曝露された動物12、13。 FA14、15 について利用可能な構造はわずかしかないため、現時点では FA が PA と構造的に関連しているかどうか、またそれらがアミロイド構造の別の分岐を形成しているかどうかは不明です。 また、この種間のFA/PAアミロイド乱交がどのような分子機構で起こるのかも明らかではない。

アミロイドフォールドは、最も安定な四次タンパク質状態の 1 つとして報告されています。 FA の事前にプログラムされた自己組織化特性は、まさにその極度の堅牢性と、最小限の介入や触媒の助けで自発的に発達する能力により、合成生物学およびバイオテクノロジーへの応用で一般の関心を集めています。 FA に由来する高度な機能性材料の開発ではいくつかの成功が報告されていますが 16、17、一連の合理的な設計原則を伝えるために、この分野がより深い構造的理解を得ることで恩恵を受けることは当然です。 最近のデノボタンパク質設計の進歩を考慮すると、これはオーダーメイドのアミロイドポリマー生産の時代の到来をもたらす可能性があると考えられます。

FA に関する構造生物学的盲点に対処するために、我々はモデル細菌 FA カーリの構造を追求しました。 カーリー繊維はグラム陰性菌の細胞外マトリックスの主要成分であり、細胞外環境で足場と接着の役割を果たして細菌群集を強化するバイオフィルム形成条件下で発現します 18,19。 大腸菌カーリの主要サブユニットは 13.1 kDa の擬似反復タンパク質 CsgA であり、これは幅広い条件下で古典的なアミロイド染色特性を持つクロスβ線維を形成する無秩序なモノマーとして分泌されます 20。 天然の状況では、細胞関連 CsgA 原線維の形成にはマイナー Curli サブユニット CsgB が必要であり、CsgB は外膜 CsgG-CsgF 分泌孔複合体に結合します 21,22。 相同性モデリング 23 、固体 NMR 24 および共進化カップリング解析 25 に基づいて、折り畳まれた CsgA モノマーの構造モデルが提案されていますが、利用可能な実験的なカーリ構造はありません。 今回我々は、細菌のrefseqデータベースの徹底的なマイニングを通じて構築されたローカルCsgAカタログの一次配列を分析することによる、アミロイドカーリコアの詳細なバイオインフォマティクス研究を紹介する。 その分析に基づいて、我々はcurliサブユニットのさまざまな構造クラスを提案し、CsgAフォールド、ひいてはcurliファイバー構造に予想される影響について議論します。 私たちは、2500 以上の CsgA 相同体配列の広範な AlphaFold 2 (AF2) モデリングに基づいて、これらの予測をテストおよび検証します。 次に、詳細なクライオ EM 解析用に 2 つの CsgA 候補を選択し、そこから提案された AF2 モデルとよく一致する距離制約と中解像度のクライオ EM ボリュームを導き出しました。 これに基づいて、我々は CsgA プロトフィブリルの分子モデルを提示し、細胞外マトリックスおよび in vitro で形成される線維における高次組織化の様式について議論します。

まず、Dueholm らによって構築された HMMcurli プロファイルを使用して Refseq 細菌ゲノム リポジトリをマイニングすることにより、ホモログ CsgA 配列のローカル データベースをセットアップしました 19。特に CsgA については、アミロイド リピートに特異的な HMM プロファイルを使用します。したがって、主要なカーリン サブユニットである CsgA と、マイナーなカーリン サブユニットおよび成核剤とされる CsgB を区別することは期待できません。 以下では、部分集団が CsgB 配列に対応することを念頭に置き、このカーリ リピート含有タンパク質のグループを CsgA と呼びます。 CsgA 配列と検証された CsgB 配列の比較は、結果セクションの最後の段落で行われます。

検索された合計201210の細菌ゲノムのうち、43279（22％）のゲノムには、1つまたは複数のcurliリピートシグネチャを保持する1つまたは複数の予測CsgA配列が含まれていました（図1a）。 これは、curli オペロン内の他の遺伝子の存在とよく相関していました。 CsgAを含む43279のゲノムから、それぞれ41041、41597、41090、および37945または1839のゲノムでCsgG、CsgF、CsgEおよびCsgCまたはCsgHが検出されました。 CsgA を含むゲノムのごく少数 (1033; 2%) だけが、curli 分泌チャネル CsgG のコピーを欠いていました。 この CsgA オーファンの数の少なさは、他の Curli 生合成タンパク質の存在との優れた相関関係と組み合わせることで、得られた CsgA タンパク質配列のデータセットが主に Curli オペロンに埋め込まれた csgA/B 遺伝子に由来していることを示しています。 これらのゲノムの大部分 (40559) には 2 つの CsgA 様コピーが含まれており、これは CsgA と CsgB26 への機能的多様化に対応すると考えられます。 興味深いことに、ゲノムには 2 つ以上の CsgA ホモログが存在し、ゲノムあたりの CsgA コピー数は 14 コピーに向かって指数関数的に減少し、最大検出数は 30 (GCF_003076275.1_ASM307627v1) になります (図 1a)。 部分的なエントリを削除した後、87205 個の推定 CsgA 配列のリストが得られます。これは、リーダー配列の切断と重複の除去により、8079 個のユニークな成熟ドメイン CsgA 様配列のデータセットに縮小されます。 CsgA ホモログごとのカーリン リピート数の初期プロキシとして、HMMER ログ ファイル内のカーリン リピートの報告されたヒット数を使用します。 これにより、4 ～ 62 のスペクトルにわたるリピート数 (WP_189563214.1) を持つ CsgA ホモログの分布が得られ、極大値は 5 または 7 ～ 8 個のカーリン リピート (前者はエシェリヒア属やサルモネラ菌などの腸内細菌に典型的) にあり、二次極大値も得られます。 15 と 22 あたり (図 1b)。 予測されたリピート数と一次配列の長さをプロットすると、カーリンリピートの平均長は 23 ± 5 であることがわかります (図 1b 挿入図)。 標準偏差が低いことは、単一のカーリンリピートの平均長が CsgA について強く保存されており、その結果、得られる繊維の横方向の寸法も同様であることを示しています (以下を参照)。

a ゲノムごとに検出された csga 相同体の数の分布。 b 予測されたカーリンリピート数の分布。 挿入図: タンパク質の長さごとのカーリンリピート数、n = 23 ± 5 aa の傾き。 c 提案されたカーリンモチーフを下に示すカーリンリピートのコンセンサス配列。 d 保存された内向き残基を強調表示したβ-ソレノイド折り畳みの軸上図。 e CsgAの3つの配列クラスの代表的な一次配列（括弧内の配列ID）。予測されたカーリンリピートに従って積み重ねられ、それぞれのコンセンサスモチーフを以下に示します（モチーフaおよびBについてはそれぞれ赤と青で色付けされ、逸脱している場合は緑で色付けされます）。

CsgA リピート数の大きな変動により、全体的な配列アライメントによるアミロイド コアの配列保存と変動性の研究が妨げられます。 むしろ、本発明者らは、CsgAカーリンリピートの原型のアミロイド核を表すQX10Qモチーフ(およびその順列)を中心とする24aaの重複しない直線状セグメント53574個を抽出した。 これから、我々は、重要な部位で顕著な保存を示し、カーリンリピートが密接に関連したモチーフaとbに分割できることを示すコンセンサス配列27を導き出し、通常、XGXXシグネチャを持つ4残基配列によって分離されており、Xは任意のアミノ酸です（図1）。 1c)。 予測される CsgA 構造 (下記参照) では、これらのカーリンリピート要素は鎖 1 と 2、および Henetin らによって定義された接続ループまたは β アーチの β アークを形成します 28。したがって、以下の赤と青で示される残基は配列ロゴ 27 (図 1c) と構造表示 (図 1d) は内側に面した立体ジッパー残基にマッピングされますが、黒色で示された残基 (図 1c) はストランド-アーク-ストランドの外側に面した表面残基にマッピングされます。単一のカーリンリピートを構成する（すなわち、βアーチ）モチーフ。 モチーフ a および b の塩基シグネチャーは N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-Q で構成されます。ここで、Ψn は疎水性残基 (A、I、V、L、F)、S または T であり、内側を指します。 β-アーチ、モチーフの先頭のよく保存された N とモチーフの終わりの Q です。 $ に対応する位置の残基は表面に露出しており、主に極性または帯電しています (T、S、D、E、Q、N、R、Y)。これは、ほとんどのカーリー繊維が親水性であることが期待できることを示唆しています。 モチーフ b の後には 4 ～ 5 個の残基が続き、最も典型的なのは XGXX-(X) モチーフです。 このループ領域は2番目のβアークを形成し、その後のカーリンリピートでモチーフbをモチーフaに接続します（図1d）。

Curliサブユニットをさらに詳細に分析すると、中心対称（CS）、非中心対称（NCS）、および縮退（D）の3つの配列クラスが特定されます（図1e）。 CSクラスには、モチーフaのコアに面する残基（すなわち、それぞれ1、3、5、7位のN、Ψ1、Ψ2、Q）がモチーフ内で（ほぼ）同一のリピートを形成するカーリンリピート配列が含まれます。 b（すなわち、位置12、14、16および18）。Pontibacter korlensisからのA0A0E3UX01を代表例として取り上げます（図1e）。 予想される三次構造（図1d）を考慮すると、これにより、コアに面した残基の配置が中心対称である立体ジッパーが得られます。 注目すべきことに、外側を向いた残基（すなわち$）は、CSクラスCsgA配列のカーリンリピートに見られる中心対称性を維持する選択圧に付着しない。 NCS クラス CsgA 配列はカーリン リピートで構成されており、モチーフ a および b のコアに面する残基が（ほぼ）完全なリピートではないため、大腸菌由来の CsgA の場合と同様に、非中心対称の立体ジッパーが生じます。またはサルモネラ・エンテリカ（図1e）。 EcCsgAでは、モチーフaではNがSに置換されており、位置Ψ1、Ψ2は大きな疎水性(I、L、M)であるのに対し、モチーフbではほとんどが小さな疎水性(A、V)です。 CsgA配列の第3のクラスは、縮重リピート、すなわち、モチーフaおよび/またはbのいずれかが不完全であるリピート(例えば、モチーフaに隣接するNまたはモチーフbにQが存在しない)、および/またはカーリンリピートは、Sediminicola sp.のA0A0S1S4K2を用いて、モチーフa(すなわち、アーク1)またはモチーフb(すなわち、アーク2)の下流に挿入された結果として、平均23残基よりもかなり長い。 代表例としてYIK13があります。 それほど一般的ではありませんが、挿入はモチーフ a または b の内側に入る場合もありますが、その代表例として Roseovarius indicus の A0A0T5PAS6 があります (図 1e)。

最後に、我々の配列分析により、CsgA配列は完全または半分のカーリンリピートで終了する可能性がある、つまり、原型的なモチーフa – アーク – モチーフb配列またはモチーフa配列のみで終了する可能性があることが明らかになりました（図1e）。 モチーフ a および b はカーリン β アーチの鎖 1 および 2 を表すため、完全または不完全な β アーチの終結は、得られる繊維のサブユニット間接触に影響を与えることが予想されます (下記を参照)。 さらに注目すべき点は、CsgA配列が単一の縮重カーリンリピートで始まる可能性があり、モチーフaとbの両方の隣接するN（S）とQが、代表的な例としてEcCsgA（図1e）で頻繁にGに変異していることです。 EcCsgAの場合、この縮重N末端リピートはN22として知られ、CsgG分泌チャネルに結合するターゲティング配列を表しますが、これはカーリ線維のアミロイドコアには組み込まれないことが判明しています20,29。 注目すべきことに、我々の配列分析は、N22 様配列の存在が規則よりも外れ値であることを示しています。 次のセクションでは、最初に、CS、NCS、および D クラス CsgA 配列の予測される三次構造と、折りたたまれた CsgA モノマーの構造的意味について説明します。 ここではカーリンモチーフとサブユニットの構造分類に焦点を当てており、系統解析については読者に Dueholm らによる以前の研究を参照していただくことに注意してください。

我々は、AlphaFold2 (AF2) の localcolabfold 実装 30,31,32 を使用して、2686 個の固有の CsgA 配列の構造を予測しました。 これは、全 CsgA データベースの代表的なサブセットを構成し、予測されるリピートの全範囲とリピート モチーフの多様性を網羅しています。 データセット全体で 83 ± 9 の平均 pLDDT 値が得られます (補足図 1 を参照)。 741 モデル (27%) では、pLDDT 値は 90 を超えていますが、237 モデル (8%) のスコアは 70 未満です。DeepMind は、pLDDT > 90 を高精度の予測として、70 ～ 90 の間を良好なバックボーン予測として報告し、pLDDT <70信頼性が低いため、慎重に扱う必要があります31。 すべてのモデルは同様のβソレノイド構造を共有しており、カーリンリピートはストランド-β-アーク-ストランドモチーフに折り畳まれ、垂直方向に積み重ねられ、一本鎖スタッガー（すなわち2.4Å）を有する位置合わせ二重平行βシート構造を生成します。両方のシートの間（図2、補足図2）。 このトポロジーは、以下で詳しく説明する、成熟カーリン原線維に関するクライオEM観察と一致します。 これは、繰り返し数の変化が CsgA モノマーの長軸寸法と直線的に相関し、カーリオムがソレノイドモノマーの連続体にまたがっていることも意味します。

各カテゴリーの代表的な例（Uniprot アクセッション ID および AF2 pLDDT スコア付き）の漫画表示。立体ジッパー残基と長軸に沿ったリピートの位置合わせを強調するために、棒表示で横断面図を以下に示します。 すべてのモデルは同じ基本構造、つまりストランドターンモチーフを繰り返すらせん状の集合体を共有しており、その結果、2 つの β アーケードが隣接する β プリーツのコアが得られます。 Pontibacter korlensis 由来の R15.5 の AF2 モデル。擬似中心対称ジッパー モチーフと、β ソレノイドの同じシート上の N 末端鎖と C 末端鎖の両方を特徴とします。 b ソレノイドの反対側に終端鎖があり、非中心対称モチーフおよび無秩序な N 末端を持つ大腸菌由来の CsgA (1-22)。 c セディミニコーラ属由来の CsgA。 可変の立体ジッパー残基を持つ YIK13 は、縮重したコア モチーフと Arc2 挿入につながります。 d 可変長のループおよびストランド挿入を有するRoseovarius indicus由来のCsgA。

CSクラスのCsgAモノマーの代表的な構造として、15のカーリンリピートとC末端に追加のハーフリピート（以下、R15.5と呼びます）を有するA0A0E3UX01（pLDDT=93.68;図2a）のAF2モデルについて説明します。 ）。 AF2 は、非常に規則的で (連続する繰り返し間の主鎖の平均 RMSD は 0.18 ± 0.02 Å)、ねじれが無視できる左巻きの β ソレノイド (上位 5 つの AF2 モデルの主鎖の平均 RMSD: 0.48 ± 0.38 Å) を予測します。 したがって、モノマーは、カーリンリピートによって形成されるβアーチのほぼ純粋な並進スタッキングから構成されます。 軸上の横方向の図は、立体ジッパーの構造的性質についてのさらなる洞察を提供します。このジッパーは、モチーフ a および b の Ψ1 および Ψ2 残基で構成され、両側にグルタミン (Gln) が隣接する中央の疎水性コアで構成されます。アスパラギン (Asn) によって、モチーフ a および b 配列の特徴に基づいて予測される疑似中心対称コアを形成します。 カーリンコアのGln 7および18の側鎖アミド基（コンセンサスモチーフ図1cの番号付け）は、広範な水素結合ネットワークに関与し、隣接するリピート内の同等のGlnと水素結合の梯子を形成します。反対側の鎖の主鎖カルボニルは、それぞれ13位または2位の親または隣接するリピートに属します（補足図3a）。 これらの相互作用は 2 枚のシート間の互い違いによって促進され、シートとシートのパッキングの安定化に大きく寄与すると考えられます。これは繰り返しあたり平均 239 Å2 に相当します。 モチーフ a および b の Ψ1 および Ψ2 残基は疎水性コアに相互嵌合しており、おそらく β ソレノイド内のシート パッキングのさらなる安定化を提供します。 注目すべきことに、私たちのHMM検索では、Sinorhizobium frediiのA0A249PTX6など、Ψ1とΨ2がSer/Thrからなる純粋に親水性のコアを形成するCSクラスのCsgA様配列が特定されました（補足図3b）。 これらの配列は標準的な N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXXN-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXX カーネルの規則的な繰り返しで構成されており、curli β ソレノイドを採用すると予測されていますが、これらは採用されませんでした。 Csg オペロンの一部を形成します。

Glnはリピート間相互作用とクロスストランドパッキングを安定化しますが、N1およびN12残基はそれぞれβ-arc 2およびβ-arc 1を安定化する広範なH結合ネットワークを形成します（補足図3a）。 Asn 1 は、+2 カーリン リピートの残基 G20、f および +1 リピートの N1 の主鎖カルボニルおよびアミドの H 結合相互作用距離内にあり、一方、N12 は X8 の主鎖の H 結合距離内にあり、 +1 リピートの G9、X10、N12。 15 のリピート全体にわたる位置 10 ～ 11 の配列保存性が低いにもかかわらず、AF2 は主鎖トレースが全体にわたって準同形であると予測し (β アーチ内の同等の位置の平均主鎖 RMSD は 0.04 ± 0.01 Å)、中断のない β が得られます。 - 連続したβアーチの主鎖水素結合によってさらに安定化されたアーケード。 β ソレノイド コア内のすべての潜在的な極性接触を繰り返しの数に対して正規化すると (つまり、表面に局在する残基を除く)、R15.5 は繰り返しごとに 29.6 個の H 結合候補を保持します。

NCS クラス CsgA モノマーの代表的な構造として、大腸菌由来の CsgA の AF2 予測 (P28307; pLDDT23-131 = 88; 図 2b) は、25.4 個の H 結合を持つ左巻き、5 リピート、β ソレノイドです。リピートあたりの候補数 (上位 5 つの AF2 モデルの平均主鎖 RMSD: 0.20 ± 0.14 Å)。 配列分析から予想されるように、モチーフ a およびモチーフ b β シート (シート 1 および 2) のパッキングにより、CS クラス CsgA に見られる中心対称性が失われます。 EcCsgA では、位置 1 の Asn カラムが Ser カラムに置き換えられ、立体ジッパーの中心対称性が壊れます。 このセリン残基の列は、β-アーク 2 も安定化しますが、アスパラギンに対して水素結合能が低いという点で、N1 の機能的代替物とみなすことができます。 EcCsgAは、モチーフa（3位と5位）のかさ高い疎水性Ψ1残基とΨ2残基とモチーフb（14位と16位）の小さな疎水性残基からなる疎水性コアでも中心対称性を失います（図2b）。 これは、CSクラスシーケンスのΨ1およびΨ2位置の対称パッキングと比較されます（図2a）。 それにもかかわらず、EcCsgA におけるシート間のパッキングは、反復ごとに 231 Å2 の埋没表面積を含み、R15.5 で見られるものよりわずかに低いだけです。 さらに対称性の喪失がβアークのレベルで明らかになります。アーク 1 は原型的な XGXX モチーフ (EcCsgA XGXG 内) で構成され、狭い曲率を持っていますが、アーク 2 は幅 4 ～ 5aa で、配列の保存性が不十分です。 連続する繰り返し間の平均主鎖 RMSD は 0.19 ± 0.01 Å で、これは R15.5 で得られた値と同様です。 EcCsgA の N 末端は、分泌シグナルとして機能することが知られている不完全なカーリン リピートを保持しており、成熟繊維内でプロテアーゼがアクセス可能な状態を維持していることが示されています 20,29。 これらの最初の 22 残基 (N22) の平均 pLDDT 値は 47 で、N22 はさまざまな AF2 予測間で一貫性がなくモデル化されており、無秩序であるか、β ソレノイド足場に部分的にドッキングされています。 最後に、EcCsgA ソレノイドはフルリピートで終了します。これは、サブユニットがそれぞれ N 末端と C 末端のシート 1 (モチーフ a) とシート 2 (モチーフ b) のオーバーハングで終了することを意味します。 ハーフリピートで終わる R15.5 では、N 末端と C 末端のオーバーハングの両方がシート 1 上に位置しています (図 2a)。

縮重リピートを持つカーリンモノマーの例として、A0A0S1S4K2 に焦点を当てます。この A0A0S1S4K2 について、AF2 は、リピートあたり平均 25.6 個の H 結合候補を持つ左巻きの 10 本鎖 β ソレノイドを予測します (pLDDT = 77.3、図 2c) (平均)上位 5 つの AF2 モデルの主鎖 RMSD: 0.62 ± 0.38 Å)。 A0A0S1S4K2 配列は、疎水性残基の置換​​を含む、モチーフ a および/または b の N 列と Q 列の偏差を示します。 これらの N/Q 置換は規則的な H 結合による立体ジッパーを破壊し、それぞれのモチーフを接続する円弧内の突起の位置に隣接することがよく見られます。 これは、隣接するリピート全体で主鎖 RMSD が適度に増加することを意味します (0.35 ± 0.07 Å)。 繰り返しになりますが、カーリンコア残基のこれらの交替は、平均 230 Å2/繰り返しを含む、β ソレノイドの折り畳み時にパッキングされるモチーフ a および b の埋没表面積に大きな影響を与えません。 4 番目の例では、対称正準カーリン折りからのさらなる逸脱が続きます。 A0A0T5PAS6 の AF2 モデルは、8 リピートの左手ソレノイドで構成され、リピート 1、2、3、および 4 のストランド 1 に挿入があります (pLDDT = 75.9、図 2d) (上位 5 つの AF2 モデルの平均主鎖 RMSD) ：0.46±0.26Å）。 等価なＣα位置（すなわち、これらの挿入を無視する）の正味の反復間ＲＭＳＤは０．４５±０．０５Åであり、前記挿入に適応するための理想的なソレノイド形状からの局所的偏差を反映している。 しかし、これは、総水素結合電位 (リピートあたり 29.5) の減少や、220 Å2 を含む繰り返しあたりのバリのある表面積の大幅な変化には影響しません。

CsgA AF2 モデルのライブラリを詳しく検査したところ、予測された β ソレノイドの利き手に曖昧さが明らかになりました。 この曖昧さは、複数の配列アラインメントにおける配列の数と相関していました。 MSA なしで実行する場合、または疎に存在する MSA の場合 (つまり、colabfold でデフォルトの mmseq2 を使用する場合)、CsgA 配列は頻繁に右手 β ソレノイドとして予測されましたが、ジャックマーを使用して一貫して取得された十分に存在する MSA を使用すると、同じ配列が AF2 を介して実行されます。左側のβソレノイドにつながります。 これは、R15.5 の補足図 4 に示されています。 興味深いことに、どちらの予測も同様の予測アライメント誤差、コンタクトマップ、全体的な pLDDT (右: 92.8; 左: 93.7) および pTM スコア (右: 0.91; 左: 0.89) を有しており、両方の可能性を先験的に区別することはできません。 R バリアントと L バリアントの最上位の AMBER 緩和モデルの MolProbity 分析 33 では、全体的に同様の構造統計が得られ、MolProbity スコアは本質的に区別できませんでした (右: 0.68; 左: 0.65)。 両モデルの利き手以外の最も顕著な違いは、β ソレノイドの 2 枚のシートの全体的なねじれでした。 右利きモデル (R) には一貫して ± 20° のねじれがありますが、左利きモデル (L) にはありません (補足図 4)。

それぞれのフォールディング経路の速度論的選択因子が存在しない場合、L モデルと R モデルは両方とも妥当な理論的最終状態であると思われます。 カーリファイバーのラセミ混合物は実際に存在するのでしょうか、それとも識別要因があるのでしょうか? R モデルのねじれがゼロではないことを考慮すると、R15.5 R プロトフィブリルは本質的にらせん状であり、立ち上がりとねじれが 7.2 nm および 20° (つまり、繰り返しごとに 4.8 Å および 1.3°) であると予測します。 、それぞれ、L-プロトフィブリルは並進対称性のみから構築されます（追加情報については、次のセクションと補足図4を参照）。 前者は、らせん状の R-プロトフィブリルがフィブリル配向の連続体にわたる 2D クラス平均を生成するため、我々の crioEM データ (下記を参照) と直接矛盾しますが、これは実験的に観察されず、R-プロトフィブリルが非常にまれであるか、世界に存在しないことを示しています。データセット。 R15.5 と同様に、AF2(mmseqs2) は 11° ツイスト (つまり、繰り返しあたり約 2.2°) の EcCsgA の右手モデルを生成しますが、AF2(jackhmmer) 左手モデルはカーリンの純粋な変換を示します。繰り返す。 繰り返しますが、後者のみが、細菌バイオフィルムから精製されたカーリン繊維に関するクライオEMデータによって裏付けられています（以下で詳細に説明します）。 これは、個々の EcCsgA ファイバーの螺旋ねじれを識別できなかった高解像度 AFM イメージングとも一致します 34。 したがって、少なくともＰ．コルレンシスおよび大腸菌ＣｓｇＡについては、インビトロおよびエクスビボの両方のカーリ線維が（主に）左手型βソレノイドを含むサブユニットから構成されることが判明した。 これまで観察されていないが、異なる CsgA ホモログまたは異なる環境条件が右利きに有利であることを除外することはできません。

カーリンモノマーの構造的特徴を確立したので、ホモおよびヘテロマー集合体の予測に注目します。 カーリンモノマーは、2.4 Å の千鳥をもつ 2 つのオープンエッジ β シートで終わります。つまり、どちらの端にも一本鎖のオーバーハングが生じます。 したがって、サブユニットは、完全または半分のカーリンリピートで終わる配列の N 末端でモチーフ a (シート 1) のオーバーハングを示し、C 末端でモチーフ b (シート 2) またはモチーフ a (シート 1) のオーバーハングを示します。それぞれ（図3a）。 2 つのモノマー間の充填界面を妥当な信頼度で予測できれば、curli 構造のモデルを推測できます。 これを行うために、まず、ねじ軸の存在や繊維極性など、繊維状タンパク質集合体の特定の特徴を正確に予測および再現する AF2 の機能をベンチマークします。 このために、エンドツーエンドで結合したβヘリックスドメインで構成されるThermus ThermophilusのバクトフィリンフィラメントのAF2予測を実行しました（2019年4月23日に寄託、AF2トレーニングセットは2018年4月30日に）。 フィラメントのcryoEM構造6RIBを参照として使用し、AF2マルチマーを使用して予測された三量体モデル（pLDDT = 86.2; pTMscore = 0.75）と比較します（補足図5）。 全体として、予測構造と実験構造の間には優れた一致があり、全原子 RMSD は 1.53 Å (2298 原子) でした。 AF2 は、フィラメントの無極性の性質 (つまり、頭から頭、尾から尾の界面の連続)、β ソレノイドの利き手、無秩序な N および C 末端尾部、およびらせん構造を正確に予測します。性質（すなわち、ねじ軸の存在）。 これにより、カーリンモデリング用に提案された AF2 方法論に対する我々の信頼が強化され、AF2 CsgA 三量体をさらに詳しく調べるようになりました。

a 完全または半反復で終わり、それぞれ C 末端モチーフ b またはモチーフ a オーバーハングを作成する CsgA 配列の単量体ビルディング ブロックの概略図。 CsgA モノマーの頭から尾または尾へのスタッキングにより、β アーケードのクロスモノマースタッキングを備えたファイバーが生成されます。 頭から尾へのスタッキングにより、ファイバー全体で平行な β アーケードが形成され、頭-頭/尾-尾の β ストランドの方向が交互になり、逆平行界面が形成されます。 半反復尾部を有する CsgA 配列の頭から尾へのスタッキングは、サブユニット界面での β アーケードの生産的な H 結合のための 21 ネジ軸を意味します。 b、c 多量体 CsgA 集合体は最小限のプロトフィブリルを表します。 b AF2 によって予測される EcCsgA 三量体。ここでは、モノマーが独自の R5/R1 界面を介して「頭から尾まで」積み重ねられ、R1 および R5 末端を持つ極性プロトフィブリル (翻訳対称のみ) が生じます。 。 破線で示される推定鎖間水素結合を有する R5/R1 界面のスティック表示。 中央の CsgA プロトマーの場合、モチーフ a とモチーフ b はそれぞれ赤と青で色付けされています。 c AF2によって予測されるR15.5二量体。2つの単量体が「頭から尾まで」積み重ねられ、互いに180°回転します。 プロトフィブリルは 1 つの独特なタイプの分子間界面 (R15.5/R1) を持ち、21 個の並進対称性と反復 R1 および R15.5 によってそれぞれ形成される極性末端を備えています。

EcCsgA三量体のAF2モデルは、βシート増加によりR5 / R1リピートを介して相互作用する3つの頭から尾まで積み重なったモノマーで構成され、連続したソレノイドフォールドを形成します（図3b、補足図6）。 このプロトフィブリル集合体は純粋な並進対称性から構築されており、ねじ軸の存在や測定可能なねじれはありません。 2 つのモノマー間の界面を見ると、β ソレノイドの水素結合ネットワークがほぼシームレスに遷移していることがわかります。つまり、R5/R1 界面には、平均数と同等の推定 23.3 個の水素結合 (三量体全体で平均) が含まれています。単一の CsgA モノマー内のリピート間の H 結合候補の数。 この連続性は、R1 と R5 の間の低い RMSD 値と、分子内接触と非常によく似た分子間指状化をもたらす立体ジッパー残基の保存によって促進されます。 モチーフA-arc1-motifB-arc2 β-アーケードは中断されることなく継続します。 AF2 は、N22 が無秩序でカーリ β アーケードから排除され、したがって線維から突き出ていると予測しており、これは報告されている成熟カーリ線維におけるタンパク質分解感受性と一致しています 20。

AF2によって予測されていないものの、CsgAは連続的な尾部から尾部/頭から頭への相互作用によってオリゴマー化することもできる可能性があることは指摘する価値があります（図3a、補足図6）。 そのために、R5/R5 の 2 つの CsgA 分子を手動で接触させ、RosettaDock を使用してローカル ドッキングを実行して、ローカル ジオメトリを最適化しました (インターフェイス スコア: -9.5)。 この尾部から尾部の二量体を、RosettaDock への入力として AF2 モデルを使用した、同様に最適化された頭から尾部の CsgA 二量体を参照します (インターフェイス スコア: -15.5)。 どちらのモデルも二量体界面に同じ数の推定上の水素結合 (23 対 21) を持っていますが、テールツーテールモデルは逆平行にパッキングし、界面で両鎖間に 1 残基の横方向のオフセットを引き起こし、貧弱な水素結合を示します。その結果、アーケードのN/Q立体ジッパーに接触します。 このようなダイマーをプロトフィブリルに外挿すると、実験的には観察されない周波数2 nmの千鳥パターンが生成され（図4cを参照）、AF2によって生成された頭から尾までのモデルが再確認されます。 さらに、我々は以前に、EcCsgA 線維が極性伸長速度論を示すことを発見しました。この観察は、curli サブユニットの頭と尾の相互作用とのみ一致します 34。

2 種類の繊維を分解した MC4100 の細胞外マトリックスの低倍率 (25k) クライオ EM 画像: 白い矢印、カーリー フィラメント。 黒い矢印、未確認の繊維、eDNA または多糖の可能性があります。 b 分離されたカーリ繊維の 60k での CryoEM 画像。 c 側面図 RELION 4.0 のカーリプロトフィブリルの 2D クラス平均。 d 15 mM MES 6.0中でin vitroで形成された組換えR15.5ファイバーの60kでのCryoEM画像。 e、f RELION 4.0 トップビューおよびサイドビュー 2D クラスの平均 R15.5。 g、h レベル 0.0137 で示された R15.5 フィブリルの RELION 4.0 Class3D クライオ EM ボリュームの上面、側面 (g; 断面として表示)、角度および軸上の図。 オレンジとシアンに交互に着色されたモノマーを使用した、cryoEM ボリューム内の R15.5 AF2 モデルの三量体ユニットのドッキング。 すべての cryoEM 画像は、10 を超える独立したサンプル調製のグリッドを表しています。

R15.5の場合、二量体化の頭から尾までのメカニズムは最初は似ているように見えます、つまり、開放端シートのドッキングと立体ジッパーの相補性を介したβソレノイドの増強です（図3c、補足図7）。 しかし、R15.5 は不均一な数の鎖 (つまり 31) を有しており、N 末端と C 末端の両方でモチーフがオーバーハングする結果になります。 この幾何学形状では、単純な並進的な頭から尾への相互作用は可能ではありません (図 3a)。 むしろ、二量体界面を横切るオーバーハングの2つのモチーフが適切に一致するには、連続した頭-頭-尾部-尾部相互作用（図3a）、または2重ネジ、つまり180本の頭-尾部相互作用からなるファイバーが必要です。 ° ファイバー長軸に沿った連続サブユニットの回転 (図 3a)。 AFMイメージングによってR15.5のインビトロアセンブリの単一繊維成長ダイナミクスを評価すると、繊維が遅い（つまり、0.8±0.1nm/s）および速い（4.5±0.1nm/s）拡張極を示すことがわかりました（補足図）。 8) これは、ファイバーが極性であるため、頭から尾への相互作用を採用している可能性があることを示しています。 R15.5界面を横切って導入されたCys残基のジスルフィド形成は、21ネジ軸に従って発生し（補足図8a、b）、AF2によるde novo予測でも、サブユニット-サブユニットの頭から尾までの21ネジが示されましたインターフェイス（図3cおよび補足図7）。 最後に、RosettaDock35 で得られた頭尾二量体と尾尾尾二量体の in silico モデルの比較により、2 つの分子間の β アーケードのシームレスな移行は前者でのみ起こり、立体構造の中心対称性によって促進されることが示されました。このCSクラスモノマーのジッパー。 このねじ軸 R15.5 界面では、32 個の推定上の水素結合が見つかります (尾部と尾部の相互作用の場合は 12 個ではなく、補足図 7)。これは、R15.5 内の繰り返し間の平均 29.6 と著しく一致しています。モノマー。 また、最後の 2 つの繰り返しでは、2 番目の β アークが 4aa から 3aa に減少していることにも注目します。 これにより、最初のモノマーの β アーケード 2 が界面を越えて 2 番目のモノマーの β アーケード 1 に続くことが完全に適応されます。

最後に、CsgA アミロイド核の配列と構造が高度に保存されていることを考慮して、異なる種の CsgA ホモログ間のヘテロマー接触を調査しました。 異種間のバイオフィルムで生成されたカーリ間で無差別交雑播種が起こることが示されているため、これは関連性があります 36。 このために、CsgA-CsgAシトロバクター-サルモネラ二量体のAF2モデルを調べました（pLDDT：79.8; pTMscore：0.78;補足図9）。 この二量体は、CsgA_シトロバクターのR5リピートがCsgA_サルモネラのR1リピートにドッキングし、ねじ軸が存在しないという点で、図3aに示すホモ三量体と概念的に同一である。 これらの結果は、保存されたリピート構造が異種モノマーのフィブリルへのドッキングを促進し、それによって種間のカーリン交差反応性を促進することを示しています。

自然の状況では、カーリ繊維は、バイオフィルム形成条件下で細胞外マトリックス (ECM) の主要成分を構成する、不規則に絡み合った塊として生成されます 18。 これは、室温でYESCA寒天上で72時間増殖させた後に大腸菌MC4100によって生成されたECMから収集した低倍率（1.88Å/pix、20k、図4a）のcryoEM画像で例示されています。 図4aでは、細菌細胞から出て細菌細胞を飲み込んでいる複数の糸状構造が確認できます。 デジタル的に抽出されたフィラメントセグメントから安定したクライオEMクラス平均を生成する試みは失敗しました。 したがって、我々は、Chapman らによって最適化された抽出プロトコルに従って ex vivo カーリ線維の単離を進めました。 37 抽出されたカーリ画分に穏やかな超音波処理 (30 秒; 10/10 秒のオン/オフパルス) を施し、ミクロンサイズの破砕ともつれをほぐしました。カーリ集合体は分散したカーリサンプルにつながり、そこからクライオEMデータセットが倍率60kで収集されました（0.784Å/ピクセル、図4b）。 ほとんどのカーリーは依然として大きなマルチフィラメント束として存在していましたが、単繊維フラグメントでは RELION 4.038 を使用した 2D 平均化が可能となり、二次構造の特徴が存在する独自の側面図クラス平均が得られました (図 4c)。 これにより、4.8Åの繰り返し、20Åのフィブリル幅、および2枚のβソレノイドシートの対向するβストランド間のハーフユニットスタッガーを特徴とするクロスベータ構造が明らかになった。 対応するパワースペクトルは、子午線に対して約 13° および 90° の角度で 1/4.8 Å-1 と 1/10 Å-1 の 2 つの広い最大値を示し、それぞれ、β ストランドの互い違いの 4.8 Å 間隔と、 2つのβシートの間隔は約10Åです（補足図10）。 これらの数値は、AF2 によって予測された EcCsgA のモノマーおよびファイバーの構造とよく一致します。 パワースペクトルに他の最大値が存在しないことは、螺旋対称性が存在しないことを示唆していますが、二重ねじ軸の形状の下で螺旋対称性が低いことは、このデータのみに基づいて判断することはできません。 しかし、AF2三量体構造の我々の分析は、ねじ軸の存在の可能性が低いことを示唆しており、Chenらによって得られたナノゴールド標識パターンも同様である。 は、カーリ線維における CsgA サブユニットの純粋に翻訳的な頭から尾への伝播と一致します 17。

また、2 つの連続する CsgA モノマー間の界面を描写する明確な特徴がないことにも注目します (単一のモノマーは 5 つのベータ-アーク-ベータ モチーフから構成されます)。また、パワー スペクトルには低解像度の最大値も存在しません。ファイバー周期を推定できます（補足図10a）。 これは、分類プロトコルにおけるカーリセグメントの横方向の整列ではフィブリルレジスターが見つからなかったことを意味します。これは、連続するモノマー間の準シームレスな移行とリピートのほぼ同形の性質の可能性のある結果です。 その結果、さまざまなフィブリル配向に対応する追加の高解像度クラス平均が不足しているため、この時点では 3D 再構成は実現できませんでした。 インビトロで成長させた EcCsgA ファイバーを使用してさらに 2D クラスを取得する試み 34 は、ファイバーの束になる傾向が高いため成功しませんでした。

EcCsgA のコロイドの不安定性の問題を考慮して、我々は CsgA ホモログの構造を追求することにしました。 このために、Asp および Glu 含有量が高い (20%; pI = 2.98) ため、R15.5 を選択し、R15.5 プロトフィブリルは静電気の反発により絡まりにくいという仮説を立てました。 R15.5 を組換えにより発現させ、封入体から精製し、バッファー交換後に重合させました。 TEM分析により、最小限の原線維間凝集のみを示すカーリー様線維が明らかになりました（図4d）。 R15.5 モチーフ a (シート 1) 表面上の立体ラダーに存在する高い Asp および Glu 含有量を考慮して、pH を変更するか、または電荷の反発を避けるために対イオンとして Ca2+ を使用することによって R15.5 フィブリル形成を調整できるかどうかをテストしました。 。 やや意外なことに、R15.5は、10 mM EDTA、15 mM MES 6.0（補足図11）または50 mMビシンpH 9.0（補足図11）の存在下、AspまたはGluラダーが形成される条件下でもフィブリルを形成しました。 R15.5 の折り畳みと重合により、電荷の反発が生じると予想されました。 ただし、15 mM MES 6.0に10 mM CaCl2を追加するか（補足図11）、またはバッファーを50 mM酢酸Na 4.0に変更する（補足図11）と、線維状凝集体の顕著な増加が観察されました。 注目すべきことに、過程にわたって収集された 1D H NMRスペクトル（R15.5はThTへの結合が弱いことを示します）の時間減衰から判断すると、pHはR15.5の重合速度論に有意な影響を及ぼさないことがわかりました（補足図12）。フィブリル化プロセスの様子。 これらの結果は、R15.5 のアミロイド生成性が強力であるが、溶媒の静電気によって繊維の凝集傾向をある程度調整できることを示しています。

図4dでは、in vitroで成長させたR15.5フィブリルの代表的なcryoEM画像と、正面図と側面図として割り当てた対応するRELION 4.0 2Dクラス平均を示します。 R15.5 の側面図は大腸菌カーリの側面図とほぼ同一であり、ex vivo のカーリと in vitro の R15.5 フィブリルが折り畳みレベルで構造的に同等であり、AF2 の予測と本質的に一致することを示唆しています。 フィブリル軸に沿ったさまざまな回転ビューに対応する追加の 2D クラス平均が補足図 13a に示されています。これは、入力モデルとして R15.5 AF2 三量体を使用して Cryosparc v3.3.2 で生成されたシミュレートされた 2D クラス平均によく対応しています (補足図 13a)。 .13b)。 RELION 4.0のRefine3Dでは、180°および72Åに対応する固定ツイストおよびライズ値（対称性：C1; T値：25）を持つヘリカル再構成を使用し、以前のジョブの最上位のClass3Dボリュームと対応するパーティクルを入力として使用し、次の結果が得られました。 7.6 Åの分解能ボリューム（FSC 0.143; 表S1）は、CsgAの予測モデルの構造的特徴、つまりフィブリル全体の寸法、クロスβ構造、カーリーリピート内の対向するストランド間の千鳥と一致し、特徴的な 4.8 Å の繰り返し間距離。 R15.5 AF2モデルのドッキング（図4h）は、実験的なcryoEMボリュームと予測されたβソレノイドアーキテクチャとの間の良好な一致を示しています。 カーリンリピートのほぼ同形かつ中心対称の特徴により、3D 粒子の整列の初期段階をガイドするための低解像度の特徴が欠如します。 表面露出フィデューシャルを導入する戦略（例、Ni-NTA 5 nm 直径ナノゴールド粒子を使用した His タグ標識、リピート 8 の arc-1 または arc-2 へのフォールディング ドメインの挿入、モノクローナル マウス抗 His 抗体による免疫染色） ) 2D および/または 3D 粒子の整列は改善されませんでした。 したがって、報告された Refine3D ボリュームは、カーリンの繰り返しにわたって縦方向に平均されたマップを表します (図 4g)。

我々の結果は、カーリプロトフィブリルが、螺旋のねじれが存在しないか無視できる程度の非常に規則的な超分子βソレノイドで構成されていることを示しています。 興味深いことに、単一のプロトフィラメントを生成することとは別に、カーリーフィブリルは不規則な、さらには体系的な高次構造を形成する傾向もあります（図5）。 たとえば、EcCsgAカーリは、平均直径が17±9 nm（平均、標準偏差、n = 108）、外れ値が最大48 nmの厚い束への横方向の関連を頻繁に示します（図5g）。 R15.5は、通常のフィブリル二量体上の単一フィブリル（上記を参照）から、複数のフィブリルが組織的に並んで積み重ねられた平面アレイに至るまで、一連の側方会合を示しました（図5a）。 このようなファイバーシートからのボックス化されたセグメントの2Dクラス平均化により、複数の平行に走るR15.5フィブリルが分解されます（図5b）。 ファイバーシートの中央領域にある 3 つのフィブリルについては、β ソレノイドの特徴が明確に解像されます。 各原線維の鎖は隣接する原線維の鎖と整列しており、これはそれらが特異的な原線維間接触を行っていることを強く示唆している。 フィブリル間のパッキングが非特異的である場合、フィブリルが相互にスライドし、単一のフィブリルのみがその二次構造特徴を解決している 2D クラス平均が得られることが予想されます。 このような状況はEcCsgA繊維二量体で観察され、一方のフィブリルは二次構造レベルで解決されますが、パートナーのフィブリルは2Dクラス平均で不鮮明な投影を示します（図5h）。 R15.5 の場合、R15.5 フィブリル間のパッキング接触は静電気によって媒介されると仮説を立てます。 具体的には、R15.5のAF2モデルは、溶媒にさらされたモチーフの側面にグルタミン酸残基とアスパラギン酸残基の正方形のグリッドがあり、大きな負に帯電したパッチを形成すると予測します（図5c）。 R15.5フィブリルのねじ軸の結果として、その負のパッチはフィブリル軸に沿って両側を交互に配置し、それによってフィブリルの両側の二価カチオンを介して隣接するフィブリル間の塩橋の形成が促進されます（図5d） ）。 15 mM MES pH 6.0 および 250 μM リン酸カリウムの存在下で、化学量論的に過剰な Ca2+ イオン (最終 CaCl2 30 mM を 3 μM R15.5 に添加) で緩衝液を補充すると、シート形成は観察されなくなります。単一のR15.5フィブリルの付着物（図5e）。 TEMは、10〜30 nmの範囲の厚い外皮に包まれたコアの直径2.5 nmのR15.5フィブリルを分解します（図5f）。 我々は、この地殻はD/Eグリッド上で核形成したリン酸カルシウムの結晶相で構成される無機堆積物であると仮説を立てています（図5c）。

平面アレイに編成された、横方向に積み重ねられた平行な R15.5 ファイバーの CryoEM 画像。 b 3つの中心フィブリルの二次構造が分解されている、R15.5アレイのコア領域のボックスで囲まれたセグメントの2Dクラス平均。 c R15.5 モノマーのシート 1 側面上の表面露出した asp および glu 残基の規則的な配列。 d フィブリル間塩橋を介した R15.5 フィブリルの超分子組織化の理想化モデル。 ねじ軸は、連続するフィブリル間の交互の結合界面を促進します。 e 30 mM CaCl2 および微量 (±250 μM) の KH2PO4/K2HPO4 の存在下での R15.5 フィブリルの外皮形成。 f e のボックス領域の拡大図。厚い堆積物に囲まれたフィブリルコア (黄色の矢印) が解像されています。 g MC4100 の ECM から精製された ex vivo カーリ線維の直径のバイオリン プロット: 実線 = 中央値、破線 = 四分位数 (n = 108 線維)。 h カーリ繊維の 2D クラス平均。分解された二次要素を持つ単一フィブリルのみ。 カーリー組織と付着物の CryoEM イメージングは​​、5 つ以上の独立したサンプル調製のグリッドを表します。

ほとんどのcurli遺伝子クラスターは2つのCsgA様タンパク質をコードしています19。 カーリオペロンが最もよく研​​究されているエシェリヒア属やサルモネラ属などの腸内細菌科では、これらの CsgA 様配列は、カーリ線維の主な自己集合構成要素を形成する主要なカーリサブユニット CsgA と、カーリ繊維の主要な自己集合構成要素を形成するマイナーサブユニット CsgB に分化します。 in vitro および in vivo の両方で CsgA アミロイド生成の核形成因子として作用します 21,22,39。 細胞表面では、CsgB は細胞外アクセサリー因子 CsgF と相互作用します。この相互作用は、細胞に関連するカーリー線維の核形成に不可欠です。 CsgB または CsgF が存在しない場合、分泌された CsgA サブユニットは折り畳まれていないモノマーとして細胞外環境に放出されます 20。 CsgB の配列と構造特性に関する見解を得るために、CsgB またはマイナー カーリン (n = 2296) として注釈が付けられたすべての固有の配列を RefSeq データベースから取得し、Signalp640 を介してそれらのシグナル配列を削除し、データセットの冗長性を < までフィルタリングしました。 90% のペアワイズ配列類似性があり、部分的なエントリがすべて削除されました。 得られた成熟ドメイン配列は、長さが50残基から561残基まで変化した(補足図14a)。 グローバルアラインメントとMSAの生成を容易にするために、同様の数のカーリンリピート（つまり、5つのリピート）を持つCsgBバリアントに分析を限定し、100〜160アミノ酸の間の配列長を翻訳して、N22領域の可変長を考慮しました。 N末端)。 得られた n = 166 CsgB 配列の厳選された MSA により、次のコンセンサス ロゴが得られました (補足図 14c を参照)。 このことから、コンセンサスロゴの中央領域は、CsgAに対して定義されたカーリンアミロイド核、すなわちN-$-Y1-$-Y2-$-Qに類似する保存された配列モチーフを示すことが明らかになる。 CsgB は、CsgA カーリーフィブリルの構造と構造的に同等であり、したがって互換性のある β ソレノイド型折り畳みを採用することが提案されています 39。 大腸菌CsgBのAlphaFold2予測は、EcCsgAに非常に類似した左手型βソレノイドを明らかにしています（Cα RMSD 0.88Å、補足図14bを参照）。 R1 のモチーフ a と C 末端リピート (R5) のモチーフ a と b の両方はあまり保存されておらず、最初の Asn の位置で標準モチーフから縮退しています。 多くの場合、これらの位置には、大腸菌 CsgB (EcCsgB) の Q、K、M のように、よりかさばる残基が保持されており、特に R5 で、カーリン リピートの疑似同型スタッキングから横に突き出ています。 CsgB モノマーの C 末端にあるこの不完全なカーリン反復が、このマイナーな線毛サブユニットの繊維集合傾向の低下の根底にある可能性があります。 以前の研究では、CsgF-CsgB 相互作用における R5 の役割も指摘されています。

アミロイド線維の構造的理解は、過去 10 年間で大きく進歩しました。 実験的なアミロイド構造の広範なプールから明らかになった共通点は、蛇行折り目、つまり、立体ジッパー相互作用と同型鎖間のスタッキングによって安定化される超ひだ超構造を形成するベータ鎖とターンの平面配置です。 。 驚くべきことに、アミロイド線維は蛇行折り目のレベル、および/またはプロトフィブリル接触レベルで高度の多型を示す可能性があります2、3、4。 一次配列や重合条件の小さな変化が、アミロイド線維の最終的な超微細構造に劇的な変化をもたらす可能性があります。 初期条件に対する四次構造の感受性は、報告されているペプチド/タンパク質のほとんどについて、特定のアミロイド構造に折り畳まれようとする進化圧力が存在しない (またはおそらく負の) 事実に起因すると考えられます。 むしろ、ほとんどの特徴づけられたアミロイドは、確率的で外部摂動の影響を受けやすいアミロイド生成プロセスを引き起こす環境トリガーの意図せぬ結果として形成されます。

これは、経路外の種や制御不能な多型が生物学的に耐えられず、したがって負の選択下にある可能性がある、進化の過程によって形成された機能性アミロイドとは顕著な対照をなしている。 これは実際にcurliの場合に当てはまるようです。 カーリに関する 20 年以上の研究にもかかわらず、線維多型の実験的観察はありません。つまり、プロトフィブリルの直径については一貫して報告されており、測定可能な螺旋対称性やその変化は報告されていません。 同様に、らせん状のカールプロトフィブリルに対応する、まばらに存在する繊維クラスの平均についても証拠は見つかりません。 カーリの場合、構造の一貫性は細胞外 CsgG-CsgF-CsgB 複合体への結合機構によって課せられる必然性があると考えられます。 核形成依存性のフィブリル化プロセスでは、CsgG-CsgF-CsgB 複合体によって構造配座異性体が導入される可能性があります。 我々は、エクスビボで単離され、インビトロで形成されたカーリのプロトフィブリルが同一のβ-ソレノイド構造を含むことを見出し、この構造がCsgA配列の固有の特性であることを強く示唆している。 さらに、CsgB サブユニットの予測構造は CsgA の構造と非常に類似しており、CsgA の折り畳みとアセンブリのための構造的に一致するテンプレートが保証されます。 カーリの場合、構造的一貫性はモノマー構成要素の保存された β ソレノイド折り畳みの形で存在します。 β-ソレノイド足場と挿入の形でのその局所的装飾の微妙な変動にもかかわらず、一次配列の大きな変動にもかかわらず、AF2予測は著しく保守的です。 平均 AF2 pLDDT は 83 で、約 8% の配列が 70 未満の低い pLDDT スコアを有することがわかりました。 局所的な pLDDT スコアが低い場合は、局所的な障害を示している可能性があります 41。 カーリでは、β ソレノイド構造におけるカーリンリピートの緊密なパッキングにより、局所的な無秩序はほとんど、またはまったく許容されませんが、カーリンのサブユニットは、カーリン繊維に組み込まれる前に本質的に無秩序な状態で見出され、カーリン繊維を通って輸送できるように折り畳まれていない状態を維持する必要があります。 CsgG チャネル 20、42。 カーリーサブユニットの低い pLDDT スコアは、プレアミロイド状態の本質的に乱れた性質を反映しているのではないかと推測するのは興味深いことです。

キャッピングドメインを欠くオープンエンドβソレノイド43,44は、二次構造モチーフの適合性に主に依存する重合機構、すなわち主に主鎖接触によって媒介されるβシートの増大とβアーケードの伸長を引き起こす。チェーン間のローカルなサイドチェーン接触では、より少ない程度でのみ発生します。 その点で、β-ソレノイドの折り畳みがカーリに限定されたものではなく、非繊維形成タンパク質にも一般的に見られることに注目するのは興味深いことです。 Protein Data Bank (http://www.wwpdb.org/) および Alphafold タンパク質構造データベース (https://alphafold.ebi.ac.uk/) の構造類似性検索により、数百の非相同性 (ペアワイズ配列同一性 < 10％）カーリンフォールドに対する高いZスコアを持つβソレノイドドメインを含む構造（>6以上、表S2、補足図15）45。 β-ソレノイドドメインを含む既知の構造には、とりわけ、不凍液および氷結合タンパク質、ファージテールスパイク、アドヘシン、Leuリッチリピートタンパク質、グリコシダーゼ、S層タンパク質が含まれます（表S2;補足図15、a）。 私たちの検索では、重合タンパク質やアミロイド様タンパク質は特定されませんでした。 その代わりに、β-ソレノイドドメインは、重合単位ではなく、タンパク質モノマーの構造足場を形成します。 これらの β ソレノイドタンパク質では、末端ソレノイド モチーフの構造的欠陥、または立体障害ドメインの追加により、モノマーの頭と尾、または尾と尾 / 頭と頭の相互作用による重合が妨げられます。 注目すべきことに、ヒトAlphafoldタンパク質構造データベースに対する構造的類似性により、ムチンやケラチン関連タンパク質、または盆地上および特徴づけられていないタンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質を含む、オープンエッジβ-ソレノイドドメインを示すいくつかのタンパク質が特定されます（補足表2;補足図15b）。プロテインFLJ40521。 ただし、これらの β ソレノイド ドメインがこれらのタンパク質の重合をサポートしているかどうかは不明です。 カーリでは、β ソレノイド全体の構造保存と相補性は、立体ジッパー接触に関与する限られた数の重要な残基の高度な保存と β アーケード構造の安定化によって保証されます。 この点に関して、我々は、Zhouらの研究者らが、異種間バイオフィルムで生成されたカーリ間で無差別交雑播種が起こり得ることを示したことに注目する。このプロセスはおそらく保存されたカーリ構造に依存している36。 また、カーリーなどの細胞外マトリックス成分は、少なくとも単一種のバイオフィルムにおいては、分泌された公共財として提案されています 46。 カーリサブユニットの構造保存により、混合繊維形成が可能となり、したがって複数種のカーリモノマーがバイオフィルムマトリックスに寄与することが可能になる可能性がある。 この研究で定義された立体配座カーリンファミリー、すなわちCS、NCS、およびDで見出されるソレノイド多型が、カーリンの交差播種の何らかの特異性をもたらし、おそらく複数種のバイオフィルムの会合を引き起こす可能性があると推測することは興味深い。 近年、共生および病原性プロテオバクテリアによって放出される、ヒトの病的アミロイドに対する潜在的なクロスシーディング活性にも注目が集まっており、α-シヌクレインのアミロイド形成に対するインビトロおよびインビボのシーディングまたは刺激活性を示す複数の報告がある12,47。 、48。 この点で、ヒトアルファフォールドタンパク質構造データベースの構造類似性により、カーリンフォールドとの高い構造類似性を持つオープンエッジβソレノイドドメインを持ついくつかのタンパク質が特定されることに注目するのは興味深いことです（補足表2;補足図15b）。ケラチン関連タンパク質やムチンなどの細胞外および粘膜タンパク質が含まれます。 このことは、腸および尿路における粘膜マトリックスタンパク質とカールを生成する共生生物および病原体との潜在的な相互作用に一層の注意を払う必要があるかもしれない。

カーリ線維は、アミロイドタンパク質のスーパーファミリーに独特のニッチを切り開きます。 カーリー線維は、病的アミロイドで典型的に観察される蛇行状のひだ、または最近ラーク様両生類抗菌薬などのペプチドベースの機能性アミロイドで見られる蛇行状のひだを示さない14。 病的アミロイドは、通常は球状の天然状態をとるポリペプチドのタンパク質分解による放出またはアンフォールディング後のペプチド断片または領域の同型スタッキングから生じます。 Curli サブユニットは球状の β ソレノイドの天然状態をとり、カーリン リピート モチーフのコア残基が高度に保存されているため、β ストランドの準同型スタッキングが生じます。 したがって、CsgAは球状タンパク質の特徴と、スタックドクロスベータ構造や核形成依存性重合などのアミロイドに関連することが多い特徴を兼ね備えています。 一方で、curli サブユニットのアミロイド化前の状態は、病的アミロイドで頻繁に見られる非晶質凝集体やオリゴマー種の形成とは関連していません。 代わりに、カーリーシードは核生成の初期の確率論的段階で形成され、すぐに、非常に堅牢なクロスβ線維の段階的かつ自己触媒的な伸長段階が続きます。 しかしその一方で、MSA分析は、独特の折り畳まれた単量体状態をほぼ決定的に予測する距離制約を提供する強力な共進化カップリングを明らかにします。 その点で、カーリの形成は、折り畳みの速度が凝集の速度に比例する可能性が高く、一次核形成が起こると折り畳みがテンプレート化されるという複雑さが加わった古典的な重合プロセスとみなすこともできます。 このモデルでは、繊維末端の一本鎖オーバーハングが、入ってくる CsgA プロトマーを動員し、折りたたむのを助けるテンプレート表面を提供すると考えられます。 少なくとも in vitro では、EcCsgA カーリ線維は、速度論が著しく異なるにもかかわらず、線維の両端から伸びています 34。 これらの極性成長動力学の構造的基盤を決定し、細胞表面上のカーリ線維の配向と生物学的に活性な成長極を決定するには、今後の研究が必要である。

最後に、内側に面した保存された残基のインターレース パターンを指すために立体ジッパーの用語を多用していますが、CsgA の場合、古典的な PA の場合のように、同じ平面内で相互嵌合が発生しません。反対側のストランドの間でよろめきます。 したがって、カーリーが古典的なタンパク質ポリマーとアミロイド線維の間の境界線を曖昧にし、機能性アミロイドの定義の再評価を促していることは明らかです。

CsgA/B ホモログを検索するために、ローカル Refseq ゲノム データベース (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/) をセットアップしました。 ゲノム検索は、Dueholm らの厳選されたプロファイル隠れマルコフ モデルを使用し、しきい値 1e-5 の HMMER v3.3.2 を使用して実行されました。19 N 末端リーダー配列は、SignalP_6.0 を使用して除去され、この成熟配列セットから削除されました。重複したエントリは削除されました。 Curlin リピート シーケンスは、一連の連続した正規表現検索を使用して抽出されました。 まず、X6QX10Q モチーフ (正規表現:.{6}Q.{10}Q) を検索し、次に 2 番目の Q が欠如しているが 1 位に N を持つ NX5QX9 モチーフ (最小 22 残基) を繰り返し検索しました (正規表現: ([az]{22,})(N.{5}QG{9,}))。 3 番目のステップでは、より長い縮退モチーフ X(AIVLSTG)X(IVLQTA)xQxGx9 も組み込み、正規表現 ([az]{22,})(..[AIVLSTG].[IVLQTA]) を使用しました。 QG{9,})。 抽出されたすべてのカーリン リピート シーケンスは単一の multi-fasta にコンパイルされ、シーケンス ロゴは Weblogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) を使用して作成されました。

CsgB 配列の分析では、CsgB またはマイナー カーリンとして注釈が付けられたすべての固有の配列を RefSeq データベースから取得し、Signalp640 を介してシグナル配列を削除し、データセットの冗長性をペアごとの配列類似性が 90% 未満までフィルタリングし、部分的なエントリを削除しました。 グローバルアラインメントとMSAの生成を容易にするために、同様の数のカーリンリピート（つまり、5リピート）を持つCsgBバリアントに分析を限定し、N22領域の可変長を考慮して100〜160アミノ酸の間の配列長を翻訳しました。 -終端)。

ホモログ データセットのバッチタンパク質構造予測は、AlphaFold2 の localcolabfold 実装 30,31,32 (https://github.com/YoshitakaMo/localcolabfold) を使用し、許容値 0.5 を使用して実行され、6 回のリサイクルで実行され、5 つのモデルが出力されました。 モデルは、pLDDT スコアを使用してランク付けされました。 図に対応するモデル。 2a、b、および 3 は、https://github.com/sokrypton/ColabFold にある AlphaFold2_advanced.ipynb Jupyter ノートブックを使用して、Jackhmmer49、許容値 0.1、24 リサイクル、5 つのモデルを出力し、上位のモデルを保持して生成されました。 多量体予測の場合、異なるサブユニットの一次配列が連結され、「/」で区切られました。

CsgA (P28307) および R15.5 (A0A0E3UX01) は、シグナル配列を持たずに C 末端タグ 6xHis タグを付けて、NdeI 部位を介して pET22b にクローン化されました。 OD600nm が 0.6 に達した後、1 mM IPTG を添加することによって BL21(DE3) ΔslyD 細胞で発現を誘導しました。 １時間の誘導後、５０００ｇで１０分間遠心分離することによって細胞を回収した。 ペレットをバッファー A (50 mM Kpi pH 7.2、500 mM NaCl、8 M 尿素、12.5 mM イミダゾール) 中で 30 分間溶解し、細胞溶解物を 40,000 g で 30 分間、20 °C で遠心分離しました。 超音波処理してライセートの粘度を下げた後、上清を 5 カラム容量 (CV) のバッファー A で平衡化した HisTrapTM FF カラム (GE Heathcare Life Sciences) にロードしました。 10 CV のバッファー A で洗浄した後、タンパク質を緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．２、８Ｍ Ｇｎｄ ＨＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール）。 関連するタンパク質画分をプールし、0.22 µm カットオフフィルターでろ過して潜在的なアミロイドシードを除去し、-80 °C で保存しました。

タンパク質ストック溶液での望ましくないアミロイド形成を防ぐために、すべての精製ステップは変性条件 (8 M 尿素) で実行され、室温での取り扱い時間は最小限に短縮されました。 このアプローチにより、CsgA および R15.5 をプレアミロイドの折り畳まれていない状態で保存することができ、バッファーをネイティブ条件 (15 mM MES pH 6.0) に切り替えることで、重合の正確な開始点を制御できます。 尿素を除去するには、ZebaTM Spin Desalting カラム (7 K MWCO) (Thermo Scientific) または 5 mL HiTrap Desalting カラム (GE Healthcare) を使用しました。

Ｒ１５．５フィラメントのネガティブ染色ＴＥＭ（ｎｓＴＥＭ）イメージングは​​、４００穴メッシュを備えたホルムバール／カーボン被覆銅グリッド（電子顕微鏡科学社）を使用して行われた。 グリッドを４ｍＡのプラズマ電流で４５秒間グロー放電させた（ＥＬＭＯ；Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 3 μl の in vitro で組み立てられた R15.5 フィラメント溶液をグロー放電グリッドに適用し、1 分間吸着させました。 溶液をドライブロットし、続いて 15 μl Milli-Q で 3 回洗浄しました。 その後、グリッドを 2% 酢酸ウラニル 15 μl 滴に 3 回、それぞれ 10 秒、2 秒、1 分間浸漬し、各浸漬の間にブロッティングステップを挟みました。 次に余分な汚れをワットマン タイプ 1 紙でドライブロットしました。 すべてのグリッドは、LaB6 フィラメントと TVIPS F416 CCD カメラを備えた 120 kV JEOL 1400 顕微鏡でスクリーニングされました。

サブユニット界面における二重ねじ軸の実験的検証を求めるために、N 末端 (R1: S10C または D21C) および C 末端 (R14 : T342C) に表面局在化 Cys を持つ二重システイン変異体を作製しました。並置され、ジスルフィド結合距離内にある（CsgA S10C / T342C）か、R15.5ねじ軸の界面（CsgA D21C / T342C）の反対側に見られます（補足図8a）。 WT CsgA、CsgA S10C/T342C および CsgA D21C/T342C の精製 in vitro 生成ファイバー、および C 末端の CsgBCys の単一システイン変異体 (X00C、100% 標識コントロールとして) 100 ng をすべて 50 mM カリウムに溶解リン酸塩、ｐＨ７．２、８Ｍ尿素、２５０ｍＭイミダゾール緩衝液を、溶液中でＩＲＤｙｅ６８０マレイミドと反応させ（室温で１時間）、遊離チオールを標識した。 繊維をＰＢＳで２回洗浄した後、（繊維を保持するための濾過による）ニトロセルロース膜上に適用し、６８０ｎｍの蛍光シグナルを測定した（Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｍを使用）。 標識効率は、非酸化性の単一 Cys 変異体 CsgBCys の蛍光シグナルに対して正規化された蛍光シグナルとして示されます。

高解像度のクライオ EM データセットは、社内で酸化グラフェン (GO) でコーティングされた Quantifoil™ R2/1 300 銅メッシュの穴あきカーボン グリッドを使用して収集されました。 GO コーティングの場合、グリッドは ELMO (Agar Scientific) グロー放電器内で 5 mA プラズマ電流で 1 分間グロー放電されました。 -176 °C、相対湿度 90% に設定された Gatan CP3 クライオプランジャーを使用して、クライオサンプルを調製しました。 合計 3 μL のアミロイド溶液を穴のあるグリッドに適用し、30 秒間インキュベートしました。 この溶液を、ワットマン タイプ 2 紙を使用してブロット力 0 で 3 秒間両面からドライブロットし、-176 °C で予冷した液体エタンにプランジ凍結しました。 高解像度クライオ EM 2D 顕微鏡写真ムービーは、SerialEM 3.0.850 で自動化されたインカラム Ω エネルギー フィルター (スリット幅 20 eV で動作) を備えた JEOL Cryoarm300 顕微鏡で 300 kV で記録されました。 動画は、K3 直接電子検出器を使用し、倍率 60k、校正ピクセル サイズ 0.764 Å/pix、露出 64.66 e/Å2 で 61 フレームにわたって計数モードで実行して撮影されました。 合計 3960 と 4455 のムービーが、ex vivo Curli と R15.5 についてそれぞれ 0.5 ～ 3.5 マイクロメートルのデフォーカス範囲内で収集されました。

線量分割されたすべてのムービーは、RELION 3.1 (Zivanov、nakane、および Scheres、2020) に実装された MOTIONCORR2 (Zheng et al.、2017) を使用して、ビーム誘発運動について補正されました。 動き補正された画像のコントラスト伝達関数 (CTF) は、CTFFIND4 (Rohou & Grigorieff、2015) を使用して計算されました。 EMAN2 パッケージ (Tang et al., 2007) の e2helixboxer.py を使用して 1000 個のフィラメントを手動でボックス化し、SPHIRE-crYOLO のトレーニング データセットとして使用しました。 次に、crYOLO モデルを使用して、すべてのデータセット内のフィラメント座標を自動選択しました。 RELION では、ボックスサイズ 300 × 300 ピクセルのフィラメント粒子が 10% のオーバーラップで抽出されました。 抽出後、ex vivo Curli と R15.5 についてそれぞれ 341691 個と 1817890 個の粒子が得られました。 非理想的な粒子をフィルタリングするために、RELION 4.0 で正則化パラメータ T 値 10 を使用して複数回の 2D 分類を実行し、各実行は 50 回の反復で構成されました。 数ラウンドのフィルタリングにより、ex vivo Curli と R15.5 のそれぞれ 41,806 個と 243,391 個の濃縮粒子のデータセットが得られました。 フィラメント画像のフーリエ変換のピークから判断すると、得られた 2D クラス平均はいずれも螺旋性の兆候を示しませんでした。 3D ボリュームを生成するために、3 ラウンドの 3D 分類が実行されました (補足図 16)。 最初の実行では、4 nm の特徴のないシリンダーが初期モデルとして使用されました。 3D 分類は、ヘリカル再構成を有効にして (ヘリカル パラメータ ライズ = 72 Å、ツイスト = 180 度)、正則化パラメータ T とクラス数をそれぞれ 25 と 3 に設定して実行されました。 この結果、粒子の 73.5% がクラス 1 に割り当てられたため、それぞれの体積は 20 Å までローパス フィルター処理され、パラメータが 1 ラウンド目と同じに設定された 3D 分類の 2 ラウンド目の初期モデルとして使用されました。 これにより、それぞれ 66.6%、20.2%、13.7% の粒子で構成される 3 つの 3D クラスが作成されました。 粒子の 66.6% を表す体積は、正則化パラメーター T を 50 に設定し、螺旋対称性を適用せずに、別のラウンドの 3D 分類の初期モデルとして使用されました。 このステップで得られたマップは、3 つのクラスすべてでそれぞれ 4.7 Å の距離で分離された β ストランドのスタックを特徴としていました。 結果として得られた 3D クラスのうち、クラス 3 は 49.2% の粒子が割り当てられた最大のグループで構成されていましたが、結果として得られたボリュームはノイズが多く、主鎖バックボーンが不連続でした。 逆に、26.3% の粒子を含むクラス 1 では、一次鎖バックボーンの接続性が大幅に向上しました。 どのクラスも、明確に定義された側鎖電子ポテンシャルを持つマップを生成しませんでした。 次に、クラス 1 に対応する 64138 個の粒子を再センタリングして再抽出し、それぞれのローパス フィルター処理されたボリュームを 3D リファインメントの初期モデルとして使用しました。 これはエラーなく完了しましたが、3D 改良によってマップの品質はあまり向上しませんでした。 次に、R15.5 の AF2 予測モデルが洗練されたマップに手動で配置され、ChimeraX で剛体フィッティングが行われました。 マップとモデルの統計は補足表 1 にあります。

高速AFMイメージングは​​、高速AFMヘッド（バージョンJPK-00178-H-12-0021）を備えたNanowizard III AFM（JPK Instruments AG）を使用してタッピングモードで実行されました。 イメージング用の基板として、ガラス支持体上に 2 成分エポキシ接着剤で接着された 10 mm 白雲母ディスク (AFM マイカ ディスク V1 Agar Scientific) を使用します。 サンプルをロードする前に (15 mM MES pH 6.0 および 1 mM CaCl2 中の 10 μM R15.5)、粘着テープを使用して雲母を切断しました。 窒化ケイ素チップ (DNP-S10) を、公称チップ半径 10 nm、バネ定数 0.06 N/m で使用しました。 CsgA 注入とイメージングの開始の間の遅延を最小限に抑えるために、サンプル アプローチは空気中で実行されました。 スキャン中にサンプルにかかる力を最小限に抑え、システム内のドリフトに対抗するために、設定電圧はチップとサンプルの接触が維持される最低レベルに継続的に調整されました。

R15.5の凝集動態を調べるために、50℃からの新たな脱塩後から開始して、100μMの折り畳まれていないR15.5モノマーの1D 1H NMRスペクトルのシグナル強度を経時的に追跡した(すなわち、プレアミロイドモノマーの濃度を調べる)。 mM リン酸カリウム、250 mM イミダゾール、8 M 尿素、pH 7.5 ～ 異なる pH (4.0 ～ 8.0) の McIlvaine 緩衝液 (クエン酸-リン酸緩衝液)。 1D 1H スペクトルは、感度を高めるための TCI 凍結プローブを備えた Bruker Avance III HD 800 MHz 分光計で、298 K で合計 10 時間、10 分ごとに記録されました。 水分の抑制は、勾配励起スカルプティング (zgesgp パルス シーケンス) によって達成されました。 ロックのサンプルには 6% の D2O が含まれていました。 NMR データは、TopSpin 3.6 (Bruker) で取得、処理、分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

本文の図で説明されている AF2 予測。 2 と 3 は、この作品の補足データとして提供されます。 CsgA R15.5 の分子モデルは、アクセッション コード 8C50 [https://doi.org/10.2210/pdb8C50/pdb] でタンパク質データバンクに寄託されました。 精製されたクライオ EM ボリュームは、アクセッション コード EMD-16431 で EMDB に寄託されました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 合理的な要求に応じて、対応する著者から追加データを入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

van der Kant, R.、Louros, N.、Shymkowitz, J. & Rousseau, F. 疾患におけるアミロイド多型の構造分析: 選択的脆弱性の手がかり? bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.03.01.433317 (2021)。

Iadanza、MG、Jackson、MP、Hewitt、EW、Ranson、NA、Radford、SE アミロイド構造と疾患を理解するための新しい時代。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 19、755–773 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Scheres、SH、Zhang、W.、Falcon、B.、Goedert、M. タウフィラメントのクライオ EM 構造。 カー。 意見。 構造体。 バイオル。 64、17–25 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lövestam、S. et al. 組換えタウの、アルツハイマー病や慢性外傷性脳症のフィラメントと同一のフィラメントへの集合。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.12.16.472950v1 (2021)。

Cao, Q.、Boyer, DR、Sawaya, MR、Ge, P.、Eisenberg, DS の 4 つの多型 TDP-43 アミロイド コアのクライオ EM 構造。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 26、619–627 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Gerven, N.、Van der Verren, SE、Reiter, DM & Remaut, H. 細菌の毒性における機能性アミロイドの役割。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 430、3657–3684 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Fowler、DM、Koulov、AV、Balch、WE & Kelly、JW 機能性アミロイド - 細菌からヒトまで。 トレンド生化学。 科学。 32、217–224 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Romero, D. & Kolter, R. 細菌の機能性アミロイド。 内部。 微生物。 17、65–73 (2014)。

CAS PubMed Google Scholar

デュエホルム、MS et al. シュードモナス属の機能性アミロイド。 モル。 微生物。 77、1009–1020 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

エヴァンス、ML 他。 細菌のカーリ システムは、アミロイド形成の強力かつ選択的な阻害剤を持っています。 モル。 セル 57、445–455 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lundmark, K.、Westermark, GT、Olsen, A. & Westermark, P. 自然界のタンパク質原線維は、マウスのアミロイド プロテイン A アミロイドーシスを増強する可能性があります: 疾患メカニズムとしての交差播種。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 102、6098–6102 (2005)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、ＳＧら。 機能性細菌性アミロイドタンパク質カーリへの曝露は、老齢のフィッシャー 344 ラットおよび線虫のα-シヌクレインの凝集を促進します。 科学。 議員第 6 号、34477 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フリードランド RP およびチャップマン MR 神経変性における微生物アミロイドの役割。 PLoS 病巣。 13、e1006654 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Bücker、R. et al. 2 つの両生類の抗菌性クロスβアミロイド線維の Cryo-EM 構造。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.01.08.475498 (2022)。

Hervas、R. et al. ショウジョウバエの記憶の持続に関与する神経機能性アミロイドのクライオ EM 構造。 サイエンス 367、1230–1234 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nguyen、PQ、Botyanszki、Z.、Tay、PK、Joshi、NS 人工カーリー ナノファイバーからのプログラム可能なバイオフィルム ベースの材料。 ナット。 共通。 5、4945 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

チェン、AYら。 操作されたセルを使用した調整可能なマルチスケール材料の合成とパターン化。 ナット。 メーター。 13、515–523 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hung, C. et al. 大腸菌バイオフィルムは、組織化された複雑な細胞外マトリックス構造を持っています。 mBio 4、e00645–00613 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Dueholm, MS、Albertsen, M.、Otzen, D. & Nielsen, PH Curli の機能的アミロイド システムは系統発生的に広く普及しており、オペロンとタンパク質の構造に大きな多様性を示します。 PLoS ONE 7、e51274 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャップマンMR他アミロイド線維形成の指示における大腸菌カーリオペロンの役割。 サイエンス 295、851–855 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hammer, ND et al. CsgB の C 末端反復単位は、細菌の機能的アミロイド核形成を指示します。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 422、376–389 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nenninger, AA、Robinson, LS & Hultgren, SJ 局所的かつ効率的なカール核形成には、シャペロン様アミロイド集合タンパク質 CsgF が必要です。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 106、900–905 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeBenedictis, EP, Ma, D. & Keten, S. カーリアミロイド線維サブユニット CsgA および CsgB の構造予測。 RSC アドバンス 7、48102–48112 (2017)。

記事 ADS CAS Google Scholar

シューメーカー、F.ら。 機能的なカーリーアミロイドは、レジスタ内平行ベータシート構造に基づいていません。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 284、25065–25076 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian、P. et al. 配列変異を使用して計算された機能的アミロイドタンパク質サブユニットの構造。 混雑する。 化学。 社会 137、22–25 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bian, Z. & Normark, S. 大腸菌における接着性表面細胞小器官の集合における CsgB の核形成機能。 EMBO J. 16、5827–5836 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crooks, GE、Hon, G.、Chandonia, JM & Brenner, SE WebLogo: シーケンス ロゴ ジェネレーター。 ゲノム研究所 14、1188–1190 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hennetin, J.、Jullian, B.、Steven, AC & Kajava, AV ベータソレノイドタンパク質におけるベータアーチの標準立体構造。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 358、1094–1105 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yan, Z.、ying, M.、Chen, J. & Li, X. カーリ生合成システムの構築と基質認識。 ナット。 共通。 11、241 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エヴァンス、R.ら。 AlphaFold-Multimer によるタンパク質複合体の予測。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034v1 (2021)。

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mirdita, M.、Ovchinnikov, S. & Steinegger, M. ColabFold - タンパク質のフォールディングを誰でも利用できるようにします。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.08.15.456425v1 (2021)。

ウィリアムズ、CJ 他 MolProbity: 全原子構造の検証を改善するための、より多くのより優れた参照データ。 タンパク質科学。 27、293–315 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スルーテル、M.ら。 単繊維分解能での細菌の機能性アミロイドの核形成と増殖。 ナット。 化学。 バイオル。 13、902–908 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyskov, S. & Gray, JJ ローカルタンパク質間ドッキング用の RosettaDock サーバー。 核酸研究所 36、W233–W238 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou、Y.ら。 細菌性アミロイド間の無差別交差播種は、種間のバイオフィルムを促進します。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 287、35092–35103 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, Y.、Smith, DR、Hufnagel, DA、Chapman, MR カーリと呼ばれる微生物の機能性アミロイドの実験的操作。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 966、53–75 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimanius, D.、Dong, L.、Sharov, G.、Nakane, T.、Scheres, SHW RELION-4.0 の自動クライオ EM 単粒子分析のための新しいツール。 生化学。 J. 478、4169–4185 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホワイト、APら。 Salmonella enteritidis の薄い凝集性線毛由来の AgfB の構造と特性評価。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 311、735–749 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

トイフェル、F.ら。 SignalP 6.0 は、タンパク質言語モデルを使用して 5 種類のシグナルペプチドすべてを予測します。 ナット。 バイオテクノロジー。 40、1023–1025 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グオ、H.-B. 他。 AlphaFold2 モデルは、タンパク質の配列が構造と動態の両方を決定することを示しています。 科学。 議員第 12 号、10696 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Gerven、N. 他カーリ生合成経路を介した融合タンパク質の分泌と機能表示。 モル。 微生物。 91、1022–1035 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Peng, Z.、Peralta, MDR & Toney, MD 構造的に定義されたβ-ソレノイドタンパク質から操作された、非常に安定したアミロイド原線維。 生化学 56、6041–6050 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ペラルタ、MDR et al. 生体材料用途のためのβ-ソレノイドタンパク質からのアミロイド原線維の操作。 ACS Nano 9、449–463 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Holm, L. Dali サーバー: タンパク質ファミリーの構造的統一。 核酸研究所 50、W210–W215 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dieltjens、L. et al. 細菌の協力を阻害することは、進化的に強力な抗バイオフィルム戦略です。 ナット。 共通。 11、107（2020）。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サンプソン、TR 他。 腸内細菌のアミロイドは、マウスのα-シヌクレインの凝集と運動障害を促進します。 Elife 9 https://doi.org/10.7554/eLife.53111 (2020)。

Bhoite, SS、Han, Y.、Ruotolo, BT & Chapman, MR ヒトマイクロバイオーム関連機能性アミロイドによって媒介されるα-シヌクレイン凝集の加速に関するメカニズムの洞察。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 298、102088 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エディ、SR プロファイルの隠れマルコフ モデル。 バイオインフォマティクス 14、755–763 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

DN 州マストロナルデ 試料の動きの確実な予測を使用した自動電子顕微鏡断層撮影法。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 152、36–51 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

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バイオ電子極低温顕微鏡 (BECM) 用 VIB-VUB 施設の Marcus Fislage 氏と Dirk Reiter 氏、およびデータ収集の支援に感謝します。 ゲノムマイニングにご協力いただいた Jolyon Claridge に感謝します。 この研究は、HR への助成金 G0G0818N および MS への G043021N を通じて、FWO による EOS Excellence in Research Program である VIB から資金提供を受けました。

構造生物学ブリュッセル、ブリュッセル自由大学、ブリュッセル、ベルギー

マイク・スルーテル、ブラジャバンドゥ・プラダン、アレクサンダー・N・ヴォルコフ、ハン・レマウト

構造および分子微生物学、VIB-VUB 構造生物学センター、ブリュッセル、ベルギー

マイク・スルーテル、ブラジャバンドゥ・プラダン、ハン・レマウト

ジャン・ジーナー NMR センター、ブリュッセル、ベルギー

アレクサンダー・N・ヴォルコフ

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MS と HR がプロジェクトを設計し、原稿を書きました。 ANV は 1D H NMR を実行しました。 MS、BP、および HR は、極低温凍結、CryoEM イメージングおよびデータ処理に貢献しました。

Mike Sleutel または Han Remaut への通信。

著者らは競合する利害関係がないことを宣言します。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Hao-Bo Guo と他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Sleutel、M.、Pradhan、B.、Volkov、AN 他。 細菌性アミロイドカーリの構造解析と構築原理。 Nat Commun 14、2822 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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受信日: 2022 年 6 月 23 日

受理日: 2023 年 4 月 20 日

公開日: 2023 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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